Compte rendu TP Technologie de l’ADN Recombinant 1

Compte rendu TP Technologie de l’ADN Recombinant 1

Objectif : Nous cherchons à exprimer une protéine recombinante animale de souris : la calpaïne, chez la bactérie Escherichia coli.

• Introduction :

Une protéine hétérologue ou recombinante est une protéine se trouvant uniquement dans une cellule qui à son matériel génétique modifié, elle n’est pas exprimée naturellement dans l’organisme. Elle est présente dans plusieurs organismes tels que les bactéries, les plantes, les champignons, les insectes, les levures et les cellules animales.

C’est un mécanisme qui est fréquemment utilisé et qui a des activités commerciales comme pour la production de l’insuline nécessaire pour les personnes diabétiques. L’insuline était prélevée auparavant sur des cadavres humains puis chez des cellules de cochon. Aujourd’hui, les scientifiques peuvent synthétiser de l’insuline à partir de cellules bactériennes.

Il va suivre une étape de purification par centrifugation en suivant le protocole de la méthode de Wizard SV Gel and PCR Clean-up system, afin de purifier l’insert pour lire la DO et réaliser la ligature. Cette purification permet d’éliminer un maximum de débris de la PCR (dNTPs, les sels, les oligonucléotides, les amorces, les tampons, les Taq Polymérases…).

Afin de contrôler la pureté et la qualité de l’insert nous réalisons une spectrophotométrie grâce à un Nanodrop. Nous avons donc obtenu, la valeur de A260/A280 = 1,89 (1,8 est la valeur minimale, 2 est de maximum de pureté, nous pouvons donc continuer l’expérience) et une concentration de 150 ng/μL de fragment de PCR purifié.

Pour obtenir la qualité et la taille du fragment de PCR nous réalisons une électrophorèse sur un gel d'agarose.

La ligature :

Il y a moins de 5% de molécules d’insert et de vecteur qui vont se ligaturer entre-elles, il faut donc respecter plusieurs règles pour rendre cette ligature optimale. Il faut que l’insert soit purifié (après l’étape de la PCR) et que la proportion d’insert et de vecteur soit comprise entre 3:1 et 8:1. Nous cherchons donc à obtenir un rapport compris entre 3:1 et 8:1 (il y a toujours plus d’insert que de vecteur), pour favoriser l’intégration de l’insert au sein du vecteur.

La Taq Polymérase ajoute des A aux extrémités 3’ de l’ADN doubles brins. Hors, le vecteur pGEM-T créé par Promega a été au préalable linéarisé par l’utilisation d’EcoRV qui n’a qu’un seul site de restriction spécifique générant des coupures à bouts francs. Promega a ajouté par la suite des T aux extrémités 3’. Ces 2 étapes ne permettent pas d’avoir un résultat 100% efficace, c’est pourquoi nous trouvons en solution plusieurs formes du vecteur (linéaire avec des T aux extrémités, linéaire avec qu’un seul T à une extrémité, linéaire sans ajout de T aux extrémités et circulaire).

Calcul de l’agarose pour les boîtes de pétries :

Nous avons une bouteille de 60 mL de LB-agar.

L’ampicilline est un antibiotique qui sert à cibler les cellules qui ont intégré le vecteur, car celui-ci possède un gène de résistance à l’ampicilline.

L’IPTG est un inducteur du lactose, il mime son action en se fixant sur le répresseur codé par LacI, ce qui permet la transcription du gène d’intérêt.

CiVi = CfVf

Ampicilline